ВведениеКобылье молоко является ценным пищевым продуктом, т. к. химические вещества, входящие в его состав, близки к женскому молоку [1–7]. Отличительной особенностью кобыльего молока является его высокая биологическая ценность и усвояемость [8, 9]. Оно успешно используется для повышения иммунитета и при лечении различных заболеваний: хронического гепатита, туберкулеза и др. [8, 10–15]. Систематическое потребление кобыльего молока в течение 4 месяцев больными экземой приводит к уменьшению зуда и гиперемии у 30–55 % пациентов. Это связано с влиянием кобыльего молока на увеличение бифидобактерий микрофлоры кишечника. Регулярное использование кобыльего молока в питании больных с воспалительными заболеваниями кишечника приводит к уменьшению болевого синдрома [10, 16, 17]. Терапевтические эффекты кобыльего молоко в гастроэнтерологии могут быть связаны с наличием в его составе лактоферрина, лизоцима и др. белков (табл. 1). Эти белки обладают бактерицидными свойствами и защищают организм от патогенных микроорганизмов, способствуя росту бифидобактерий. Следует отметить положительную роль лактоферрина в воспалительных процессах и стимулировании гуморального иммунитета [11, 18]. Благодаря наличию в кобыльем молоке большого количества сывороточных белков оно, как и материнское, относится к альбуминовомутипу [2]. Из-за сезонности получения кобыльего молока разработаны технологии его сушки с сохранением биологических свойств [19–21].Кобылье молоко находит все более широкое применение при разработке функциональных продуктов питания, обладающих лечебно-профилактическим действием. Таким продуктом является кумыс, который широко используется при лечении различных заболеваний. Его отличает низкое содержание белка, что снижает его питательные свойства.В новых формулах пищевых продуктов используется смесь кобыльего и коровьего молока. Обогащение кобыльего молока коровьим при производстве кумыса приводит к изменению его реологических свойств. Это связано с тем, что основным белком коровьего молока является казеин, который составляет 78–85 %. Он представлен рядом форм, которые различаются по содержанию: 43–55 % составляет группа α-казеинов, 24–35 % – β-казеин, 8–15 % – κ-казеин [22–24].Первичная структура αS1-, αS2-, β- и κ-казеина имеет невысокую гомологию [22, 23]. Изоэлектрическиеточки всех форм казеинов лежат в области рН 4,6–4,7 [25]. Функциональные свойства компонентов казеиновой фракции молока также различны. αS1-, αS2- и β-казеин относятся к фосфопротеидам и осаждаются в присутствии кальция в отличие от κ-казеина. Однако αS1-, αS2-, β- и κ-казеин имеют общие уникальные свойства, выделяющие их среди других белков молока. Это фосфорилированные белкиKurchenko V.P. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 2, pp. 402–412 Таблица 1. Состав и содержание сывороточных белков в кобыльем, коровьем и женском молоке [2]Table 1. Composition and content of whey proteins in mare’s milk, cow’s milk, and human milk [2] Состав сывороточных белковЗначениеКобылье молокоКоровье молокоЖенское молокоСодержание сывороточных белков в молоке, %Среднее38,7917,5453,52β-лактоглобулинСреднее (мин–макс)30,7525,3–36,353,5952,9–53,60α-лактальбуминСреднее (мин–макс)28,5527,5–29,720,1018,4–20,142,3730,3–45,4ИммуноглобулиныСреднее (мин–макс)19,7718,7–20,911,7310,1–11,718,1515,1–19,7Альбумин сывороткиСреднее (мин–макс)4,454,4–4,56,205,5–76,77,564,5–9,1ЛактоферринСреднее9,898,3830,26ЛизоцимСреднее6,59–1,66  с относительно высоким содержанием пролина (10 Pro в αS1-казеине и 35 Pro в β-казеине), молекулярной массой 19–25 кДа и невыраженной третичной структурой, лишенной дисульфидных мостиков [22]. κ-казеин, в отличие от α- и β-казеинов, является кальций устойчивой фракцией белков молока, т. к. содержит только один фосфосериновый остаток. В связи с этим κ-казеин практически не связывает ионы кальция и не теряет растворимости в их присутствии. Также растворимость κ-казеина связана с наличием в его структуре галактозы, N-ацетилгалактозамина и N-ацетилнейраминовой кислоты. Они содержат значительное количество гидроксильных групп, что обеспечивает молекуле белка высокий отрицательный заряд. В комплексе с α- и β-казеинами κ-казеин образует стабильные мицеллы [22].В мицелле казеины распределены нерегулярно: выделяют центральную гидрофобную и пери- ферическую гидрофильную области, в которой располагаются основные сайты фосфорилирования. Гидрофильная область обуславливает связывание с кальцием и транспортную функцию белков.Располагаясь на поверхности мицелл, κ-казеин выступает в виде защитного коллоида по отношению к кальций неустойчивым белкам [26]. Четвертичная структура казеинов представляет собой непрочно связанные друг с другом мицеллы. Мицелла казеина состоит из субмицелл диаметром 10–20 нм, которыесостоят из αS1-, αS2-, β- и κ-казеинов в соотношении 3:1:3:1. Субмицеллы связываются друг с другом за счет кальций-фосфатных мостиков. Они формируются такимобразом, чтобы гидрофобные участки располагались в центральной части мицеллы, а гидрофильные области κ-казеина и фосфатные группы αS1-, αS2- и β-казеинов – на поверхности, создавая отрицательный заряд мицелл. В присутствии кальция, цитратов и фосфатов фракции казеинов самоассоциируются и, взаимодействуя друг с другом, образуют ассоциаты различных размеров [26]. Исследования показали, что мицеллы казеина коровьего молока являются высокоорганизованными структурными единицами сферической формы диаметром от 40 до 300 нм.Устойчивость мицелл казеинов зависит от рН, ионной силы и температуры. В процессе ферментации кисломолочного продукта изменяется рН в кислую область. При этом ионы водорода связываются с ионизированными СООН-группами казеинов, что ведет к уменьшению числа отрицательных зарядов на поверхности белковых частиц. Это приведет к нарушению гидратной оболочки мицелл и снижению растворимости белка. Когда величина рН становится близкой к изоэлектрической точке казеинов, то его мицеллы коагулируют и образуют сгусток молока [23, 26]. Реологические свойства такого кисломолочного продукта из коровьего молока отличаются от кумыса, изготовленного из кобыльего молока. В кобыльем молоке содержание казеина значительно меньше, чем в коровьем, и составляет 50 %. Мицеллы казеина содержат β-казеин. Доля κ-казеина в кобыльем молоке меньше, чем в коровьем. Различия состава казеинов в коровьем и кобыльем молоке ведет к различиям в структурной организации их мицелл. В результате ферментации кобыльего молока коагуляция казеинов менее выражена, чем в коровьем. При добавлении к кобыльему молоку различного количества коровьего процесс ферментации приведет к образованию плотного сгустка полученного кисломолочного продукта и улучшению его реологических свойств.Возрастающая потребность в кобыльем молокепри создании новых функциональных продуктов приводит к его фальсификации путем добавления большого количества доступного коровьего молока. Это существенно снижает качество и безопасностьКурченко В. П. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 2 С.402–412 таких продуктов. В связи с этим актуальной задачей является разработка метода идентификации кобыльего молока и его смеси с коровьим. Этот метод может найти применение при идентификации сухого кобыльего молока и кисломолочных продуктов из него. В настоящее время отсутствуют методы идентификации кобыльего молока и его смеси с коровьим.Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) позволяет идентифицировать видовую принадлежность молока по белкам, входящим в его состав. Анализ может быть проведен по сывороточным белкам молока [27, 28]. Белки сыворотки кобыльего и коровьего молока различаются по аминокислотному составу. В связи с этим они имеют различное сродство к гидрофобной матрице C18, которой заполнена хроматографическая колонка. Разделение белков сыворотки молока и оценка их количественного содержания позволит идентифицировать процент разведения кобыльего молока коровьим. Для использования ВЭЖХ- анализа кобыльего и коровьего молока необходимо оптимизировать время разделения белков и условия использования линейного градиента концентрации ацетонитрила.Целью работы являлась разработка методов идентификации кобыльего, коровьего молока и их смеси. Объекты и методы исследованияОбъектами исследования служили сыворотки кобыльего, коровьего молока и их смесей. В работе использовали 3 образца кобыльего и коровьего питьевого молока, а также 2 образца сухого кобыльего молока (KZ.3510317.24.01788) ТОО «ЕвразияИнвест Ltd» (Республика Казахстан).Подготовка проб сыворотки кобыльего, коровьего молока и их смесей для проведения анализа. Кобылье и коровье молоко содержит большое количество казеина, который затрудняет использование электрофоретических и хроматографических методов их идентификации. Для определения видовой принадлежности кобыльего, коровьего молока и их смесей использована сыворотка, которую получали путем кислотной коагуляции казеина. Свежее цельное кобылье или коровье молоко охлаждали до 5 °С и центрифугировали при 10 тыс. об/мин в течение 30 мин. Отделяли верхнюю фракцию липидов. Обезжиренное молоко фильтровали через капроновый фильтр. В обезжиренное молоко, которое нагревали в термостате Precitherm PFV при температуре 37 °С, постепенно вносили 50 % раствор HCl до достижения рН 4,5. При этом значении рН происходит коагуляция казеина. Через 30 мин свернувшееся молоко охлаждали до комнатной температуры и отделяли осадок казеина центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение10 мин. Внесением к полученной сыворотке 1 М раствора NaOH доводили рН до 6,5. Полученные пробы хранили при 4 °С. Для ВЭЖХ-анализа использовались полученные сыворотки кобыльего и коровьего молока и их смеси в соотношениях 90:10, 75:25, 60:40, 45:55,30:70 и 15:85 % соответственно.Методика ВЭЖХ анализа сывороток кобыльего, коровьего молока и их смесей. Белковый состав сывороток кобыльего, коровьего молока и их смесей анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием хроматографа Agilent 1200 с диодно-матричным Agilent G1315C детектором. Разделение компонентов проб проводили на колонке Machinery Nagel C18 4.6×250, 5 мкм (США) при температуре 25 °С и скорости элюции 1 мл/мин. Поглощение элюата измеряли при 214 и 280 нм. Объем пробы для инжекции составлял 20 мкл с концентрацией белка, эквивалентной 2 мг/мл. Перед нанесением на колонку все пробы фильтровали через 0,45 мкм фильтр. Для разделения белков сывороток молока был использован градиентный режим элюирования с изменением содержания ацетонитрила подвижной фазы В от 0 до 50 % в 0,1 % трифторуксусной кислоте. Фаза А – 0,1 % трифторуксусной кислоты в воде. Время хроматографического разделения составляло 60 мин. Количественный анализ хроматограмм с диодно- матричным детектором проводили с использованием компьютерного обеспечения Agilent Technologies Inc. (США) [27, 29]. Измерения произведены в трех независимых опытах. Результаты и их обсуждениеПригодными методами для идентификации видовой принадлежности молока различных видов сельскохозяйственных животных являются методы разделения белков молока различными электрофоретическими методами и высокоэффективной жидкостной хроматографией.В кобыльем и коровьем молоке существуют значительные различия в содержании сывороточных белков: β-лактоглобулина (β-лг), α-лактоальбумина (α-ла) и сывороточного альбумина (табл. 1) Для идентификации видовой принадлежности молока различных видов копытных животных удобно использовать сывороточные белки. Благодаря межвидовым различиям в первичной структуре β-лг, α-ла и сывороточного альбумина их физико-химические свойства будут существенно различаться [27–30].Несмотря на различие в первичной, вторичной и третичной структуре белков молока различных видов копытных животных, они имеют близкие молекулярные массы. Для идентификации белковых соединений различного происхождения широко используется метод их электрофоретического разделения вKurchenko V.P. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 2, pp. 402–412  a b c Рисунок 1. Хроматографический профиль ВЭЖХ анализа белков сыворотки:a – коровьего молока (1 – α-лактоальбумин, 2 – А форма β-лактоглобулина, 3 – Б форма β-лактоглобулина);b – кобыльего молока (1 – α-лактоальбумин, 2 – β-лактоглобулина); c – смеси кобыльего и коровьего молока при их соотношении 45:55 % (1 – α-лактоальбумин кобыльего молока 2 – α-лактоальбумин коровьего молока) при 214 нмFigure 1. HPLC analysis of whey proteins: a – cow’s milk (1 – α-lactoalbumin, 2 – A form of β-lactoglobulin, 3 – B form of β-lactoglobulin); b – mare’s milk (1 – α-lactoalbumin, 2 – β-lactoglobulin); c – mix of mare’s and cow’s milks at a ratio of 45:55% (1 – α-lactoalbumin of mare’s milk 2 – α-lactoalbumin of cow’s milk) at 214 nmКурченко В. П. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 2 С.402–412 Таблица 2. Время удержания на хроматографической колонке и площадь пиков белков сыворотки кобыльего и коровьего молока и их смеси в ВЭЖХ-анализеTable 2. Retention time on the chromatographic column and the area of the peaks of proteins in the whey samples accordin to HPLC analysis Сывороточные белкиПоказатели ВЭЖХ-анализаСыворотка коровьего молокаСыворотка кобыльего молокаСмесь сывороток кобыльего и коровьего молока, 45:55 %α-лактоальбуминВремя удержания, мин40,35245,42440,303    45,439 Площадь пика, %6,298014,6294,642    8,187β-лактоглобулинВремя удержания, мин,51,49251,566  А форма54,414  Б форма   Площадь пика, %21,10248,417  А форма66,620  Б форма   полиакриламидном геле. В результате денатурации белков додецилсульфатом натрия они различаются только по их молекулярной массе и имеют близкие заряды. Раннее экспериментально показано, что метод электрофоретического разделения денатуриро- ванных белков козьего, коровьего и человеческого молока не позволяет определить их видовую принадлежность [27].Использование ВЭЖХ для разделения белков сыворотки кобыльего, коровьего молока и их смеси основано на значительных отличиях их первичной структуры. Замены аминокислот в первичной структуре белков сывороток кобыльего и коровьего молока приводит к различиям в их физико-химических свойствах, что позволяет оптимизировать процесс их разделения в ВЭЖХ-анализе. Для оптимизации разделения сывороточных белков было подобрано время проведения хроматографии (60 мин), использован линейный градиент концентрации ацетонитрила (от 0 до 50 %) и объем пробы для инжекции (20 мкл). На рисунках 1–3 представлены результаты оптимизированного ВЭЖХ анализа нативных белков сывороток кобыльего и коровьего молока и их смеси. Из полученных хроматограмм рассчитано время удержание белков и площади их пиков, которыепредставлены в таблице 2.Анализ результатов разделения белков сыворотки коровьего молока показал, что содержание α-ла и β-лг соответствует ранним полученным результатам, представленными в таблице 1 [2]. Время удержания β-лг коровьего молока А и Б форм различается (рис. 1a, пики 2 и 3). С наибольшей частотой встречаются генетические варианты β-лг А и В с молекулярной массой 18 362 Да и 18 276 Да соответственно. Отличия в аминокислотных последовательностях заключается заменой Gly→Asp в позиции 64 и Ala→Val в позиции 118для вариантов А и В соответственно. Первичная структура β-лг представлена цепью из 162 аминокилот с 5 цистеиновыми остатками, четыре из которых образуют дисульфидные мостики (Cys66–Cys160 и Cys106–Cys119) с пятым свободным тиолом (Cys121). Вторичная структура белка содержит β-складчатые слои (43 %), α-спирали (10 %) и неорганизованные структуры (47 %), включая β-петли [22, 29, 31, 32]. В кобыльем молоке β-лг представлен одной формой и время его удержания на хроматогафической колонке совпадает с временем удержанием А формы коровьего β-лг (рис. 1a пик 2, 1b пик 2). Это свидетельствует о сходстве их физико-химических свойств и первичной структуры.Это обстоятельство не позволяет использовать сывороточный β-лг в качестве маркера кобыльего молока. В оптимизированных условиях проведения ВЭЖХ-анализа удалось добиться значительного различия времени удержания α-ла коровьего и кобыльего молока, которое составило 40,35 и 45,24 минуты соответственно (рис. 1a пик 1, 1b пик 1). Этот сывороточный белок может быть использован в качестве маркера при идентификации кобыльего молока и его смеси с коровьим.Лактоальбумин – второй по значимости глобулярный белок сывороточной фракции кобыльего и коровьего молока (табл. 1). В отличие от β-лг α-ла присутствует в женском молоке. Молекулярная масса мономера α-ла коровьего молока составляет 14 178 Да, изоэлектрическая точка – pI 4,6. В белке не обнаружены свободные сульфгидрильные группы, но выявлены четыре дисульфидных мостика. Они расположены в аминокислотных позициях 6 и 120, 28 и 111, 61и 77, 73 и 91 и ограничивают гибкость структуры α-ла в определенных условиях. Лактоальбумин содержит несколько участков с регулярной вторичной структурой: α-спирали (40 %), 310-спирали (20 %),Kurchenko V.P. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 2, pp. 402–412  a b Рисунок 2. Первичная структура кобыльего (a) и коровьего (b) α-лактоальбумина [36]Figure 2. Primary structure of mare’s (a) and cow’s (b) α-lactoalbumin [36]16Площадь пика, % 141210864200 20 40 60 80 100Массовая доля кобыльего молока в смеси с коровьим, % α -лактоальбумин коровьего молокаα -лактоальбумин кобыльего молока β-структуры (6 %) и значительное количество (44 %) неорганизованных участков [22]. α-спираль является наиболее распространенной вторичной структурой белков и характеризуется плотными витками вокруг длинной оси молекулы и стабилизированными водородными связями между H и O пептидных групп. 310-спираль очень «тугая», имеющая в сечении форму треугольника. В образовании β-складчатых структур преобладают обычно глицин и аланин.Лактоальбумин проявляет двойную функцию: связывает β-1,4-галактозилтрансферазу с образованием регуляторной субъединицы для синтеза лактозы. Кроме того, он способен вызывать апоптоз клеток. Белок представляет собой металлопротеин, связанный с кальцием, который необходим для создания складчатости и структурной стабильности [33, 34]. Он может существовать в димерной форме с молекулярной массой 28 кДа, которая индуцирует гибель клеток, в то время как мономерный α-лактальбумин 14 кДа неактивен [34, 35].В процессе хроматографии время удержания α-ла кобыльего и коровьего молока связано со значительными различиями в их первичной и вторичной структуре. Сравнительный анализ первичной структуры кобыльего и коровьего α-ла показывает наличие 33 замен аминокислот (рис. 2) [36]. Такое большое количество замен аминокислот в первичной структуре лактоальбуминов приходит к изменению их вторичной структуры. В связи с этим они имеют различное сродство к гидрофобному сорбенту колонки Machinery Nagel C18, которая использовалась для разделения белков сыворотки молока. Вследствие значительных отличий первичной структуры сывороточных α-ла и различий в ВЭЖХ-анализе этот белок является белком-маркером видовой принадлежности кобыльего, коровьего молока и их смеси.По площадям пиков хроматограмм белков сыворотки кобыльего, коровьего молока и их смеси в соотношениях 90:10, 75:25, 60:40, 45:55, 30:70 и 15:85 % соответственно дана оценка содержания α-ла вРисунок 3. Зависимость содержания α-лактоальбумина в сыворотке кобыльего молока при добавлениив нее сыворотки коровьего молока (инжекция 20 мкл сыворотки в ВЭЖХ-анализе)Figure 3. Effect of cow’s milk whey on α-lactoalbumin content in mare’s milk whey (injection of 20 μlof whey during HPLC analysis) исследованных образцах. На рисунке 3 по результатам использования ВЭЖХ-анализа показано содержание α-ла в сыворотках кобыльего молока в зависимости от ее разведения сывороткой коровьего молока.При оценке содержания α-ла в сыворотке кобыльего молока и ее смеси с сывороткой коровьего можно определить процент разведения кобыльего молока коровьим. Предложенная методика позволяет определить 10 % добавленного коровьего молока к кобыльему. Для понижения нижнего предела определения α-ла коровьего молока в смеси с кобыльем можно использовать для инжекции не 20 мкл сыворотки, а 40 мкл образца. Это позволит определить минимум 5 % добавленного коровьего молока. Методика может быть использована для идентификации видовой принадлежности кобыльего молока, сухого кобыльего молока и кисломолочных продуктов из него. ВыводыПо результатам проведенных исследований показана возможность использования ВЭЖХ для идентификации видовой принадлежности кобыльего молока и его смеси с коровьим молоком. Для анализа используются молочные сыворотки указанных объектов исследования. Белками-маркерами коро- вьего и кобыльего молока в ВЭЖХ-анализе являются α-лактоальбумины. При использовании линейного градиента концентрации ацетонитрила время удержания кобыльего α-лактоальбумина составляет 45,16 мин, коровьего – 40,09 мин. Показано, что в первичной структуре кобыльего α-ла имеется 27,5 % замен аминокислот по сравнению с первичнойКурченко В. П. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 2 С.402–412 структурой коровьего α-ла. Эти замены привели к изменению физико-химических свойств и уменьшению гидрофобности кобыльего α-ла. Благодаря этому явлению уменьшилось время удержание этого белка на используемом гидрофобном сорбенте в ВЭЖХ- анализе. При оценке количественного содержания сывороточного α-лактоальбумина можно определить процент разведения кобыльего молока коровьим. Методика позволяет определить минимум 5 % добавленного коровьего молока к кобыльему.Предлагаемая методика идентификации видовой принадлежности кобыльего молока имеет большие преимущества, по сравнению с другими методами, т. к. позволяет в течение 1 часа определить состав сывороточных белков кобыльего, коровьего молока и их смеси. Использование этой методики дает возможность определить в 1 литре кобыльего молока до 50 мл добавленного коровьего. Критерии авторстваВ. П. Курченко – руководство проектом, сбор и обобщение материала. Е. С. Симоненко – сбор и обобщение материала, написание раздела статьи по методам исследования. Н. В. Сушинская иА. Н. Петров – проведение экспериментальных работ по ВЭЖХ-анализу белков сыворотки кобыльего и коровьего молока. Т. Н. Головач – сбор, обобщение материала по свойствам белков кобыльего молока. С. В. Симоненко – руководил проектом, написание введения в статью. Конфликт интересовАвторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. ContributionV.P. Kurchenko supervised the project, collected the data, and analyzed the material. E.S. Simonenko collected the data, analyzed the material, and described the methods. N.V. Sushynskaya and A.N. Petrov performed the HPLC analysis. T.N. Halavach collected and generalized the material on the properties of mare’s milk proteins.S.V. Simonenko supervised the project and wrote the introduction. Conflict of interestThe authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this article.