STUDY ON PROTEOLYSIS INTENSITY OF ENZYME SYSTEMS FORMED BY FUNGI OF GENUS OF PENICILLIUM AND RENNET
Rubrics: FOOD PRODUCTION TECHNOLOGY
Authors:
1.
Kemerovo Institute of Food Science and Technology (University)
2.
LLC “Firm “Kaloriya”
3.
Kemerovo Institute of Food Science and Technology (University)
4.
Kemerovo Institute of Food Science and Technology (University)
5.
Kemerovo Institute of Food Science and Technology (University)
6.
Kemerovo Institute of Food Science and Technology (University)
Type:
Article
Pages:
from 30
to 34
Status:
Published
Received:
30.12.2015
Accepted:
30.12.2015
Published:
30.12.2015
Subject area:
UDK 577.151
UDK 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
UDK 60 Прикладные науки. Общие вопросы
UDK 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
UDK 60 Прикладные науки. Общие вопросы
Language:
Russian
Keywords:
Mold fungi of the genus of, cheese, proteolytic enzyme system, proteolysis, hydrolysis of proteins, peptides, free amino acids, organoleptic characteristics
Abstract (English):
Proteolysis is the main process among those occurring during cheese ripening. In cheese ripening process proteolysis takes place under the influence of specific enzymatic systems known as proteinases, milk-curdling enzymes and those synthesized by various microflora which is presented in cheese. Due to proteolytic reactions cheeses are enriched with an ammonia solution, the density of cheeses being reduced and their consistency being improved by becoming firmer. The catalytic activity of the enzyme systems of mold fungi Penicillium caseicolum has been studied . The research results revealed that acidic protease has the highest proteolytic activity, its value reaching 1.20 ± 0.07 uM (substrate) / mg (protein) ch. Acidic carboxypeptidase has the same catalytic activity as the alkaline aminopeptidase. The activity of these enzymes in the mycelium of mold fungi Penicillium caseicolum is 1.17 ± 0.07 uM (substrate) / mg (protein) ch, while metalloprotease has catalytic activity 1.14 ± 0.06 uM (substrate) / mg (protein) ch. The research results revealed that the combined use of mold fungi Penicillium caseicolum and rennet accelerates proteolytic processes when ripening of soft cheeses occurs. Electrophoretic analysis of cheese peptide profiles study demonstrates that mold fungi Penicillium caseicolum are the carriers of the proteolytic system of high activity. Thus, after 12 hours of protein substance hydrolysis their mass fraction lowed by 9-13%, and the mass fraction of free amino acids and peptides of different molecular weight increased. It has been established that the additional introduction of rennet into the sample accelerates the proteolytic processes. According to the presented peptide profiles the rate of accumulation of organic nitrogenous compounds increases.
Proteolysis is the main process among those occurring during cheese ripening. In cheese ripening process proteolysis takes place under the influence of specific enzymatic systems known as proteinases, milk-curdling enzymes and those synthesized by various microflora which is presented in cheese. Due to proteolytic reactions cheeses are enriched with an ammonia solution, the density of cheeses being reduced and their consistency being improved by becoming firmer. The catalytic activity of the enzyme systems of mold fungi Penicillium caseicolum has been studied . The research results revealed that acidic protease has the highest proteolytic activity, its value reaching 1.20 ± 0.07 uM (substrate) / mg (protein) ch. Acidic carboxypeptidase has the same catalytic activity as the alkaline aminopeptidase. The activity of these enzymes in the mycelium of mold fungi Penicillium caseicolum is 1.17 ± 0.07 uM (substrate) / mg (protein) ch, while metalloprotease has catalytic activity 1.14 ± 0.06 uM (substrate) / mg (protein) ch. The research results revealed that the combined use of mold fungi Penicillium caseicolum and rennet accelerates proteolytic processes when ripening of soft cheeses occurs. Electrophoretic analysis of cheese peptide profiles study demonstrates that mold fungi Penicillium caseicolum are the carriers of the proteolytic system of high activity. Thus, after 12 hours of protein substance hydrolysis their mass fraction lowed by 9-13%, and the mass fraction of free amino acids and peptides of different molecular weight increased. It has been established that the additional introduction of rennet into the sample accelerates the proteolytic processes. According to the presented peptide profiles the rate of accumulation of organic nitrogenous compounds increases.
Keywords:
Mold fungi of the genus of, cheese, proteolytic enzyme system, proteolysis, hydrolysis of proteins, peptides, free amino acids, organoleptic characteristics
Mold fungi of the genus of, cheese, proteolytic enzyme system, proteolysis, hydrolysis of proteins, peptides, free amino acids, organoleptic characteristics
Введение Среди процессов, лежащих в основе созревания сыров, основным является процесс протеолиза. Хорошо известен тот факт, что чем глубже протекает протеолиз, тем выше органолептические показатели сыров. Протеолиз в процессе созревания сыра протекает под влиянием специальных ферментных систем - протеиназ, молокосвертывающих ферментов, а также энзимов, синтезируемых различной микрофлорой, присутствующей в сыре. Благодаря протеолитическим реакциям сыры обогащаются аммиачным раствором, снижается плотность сыров и улучшается их консистенция - становится более упругой. На первых стадиях созревания сыр имеет горь кий вкус. Прежде всего это связано с тем, что на начальных стадиях процесса образуется большое количество пептидов, отличных друг от друга мо лекулярной массой, но при дальнейшем их гидро лизе горечьисчезает. Неприятный вкус сыра образуется за счет при сутствия низкомолекулярных пептидов, кроме этого, вкус сыра зависит от вкуса аминокислот, входящих в состав низкомолекулярных пептидов и занимающих терминальное положение в пептидной цепи. Отщепление из полипептидной цепи аминокислоты, обусловливающей неприятный горький вкус с помощью протеиназ, способствует устранению горечи. Тем не менее неуправляемый протеолиз также может привести к появлению неприятного вкуса. Разнообразные факторы, вызывающие появление горьких полипептидов в сыре, проявляют свое действие либо через изменение физикохимических свойств белковых компонентов сыра, либо через изменение активности ферментных систем (эти параметры зависят от рН, содержания соли и воды в сыре, температуры созревания), что и обусловливает изменение характера и направленности протеолизав созревающем сыре. Согласно литературным данным химическими показателями процесса созревания сыра являются методы качественной и количественной оценки протеолиза: экстракция азотсодержащих компонентов сыра и их фракционирование специфическими осадителями с последующим определением азота во фракциях методом Кьельдаля, электрофорез, хроматография [1]. Степень разрушения белковой молекулы следует анализировать по переходу белкового азота в растворимую форму (метод Кьельдаля). Использование данного метода для количественной характеристики процесса протеолиза является общепринятым. Установлено, что при воздействии ферментной системы плесневых грибов на казеин молока образуется разнообразный набор продуктов реакции. Эта проблема изучена неполно, и до сих пор остается вопрос о том, каким образом оценивать свойства и каталитическую активность плесневых грибов в частности, плесневых грибов рода P. сaseicolum. Процесс протеолиза сыра протекает не только под действием ферментной системы плесневых грибов, но и еще под влиянием сычужного фермента, применяемого для коагуляции молока. В результате ферментативной реакции казеин молока под влиянием сычужного фермента распадается на олигопептиды с различной молекулярной массой: более 50 % составляют олигопептиды с молекулярной массой менее 16 000 Да и всего 5 % и менее образуются олигопептиды с молекулярной массой менее 3000 Да [1, 2]. У технологов молочной промышленности и сыроделов прижились такие термины, как «глубина» и «ширина» протеолиза. Под «глубиной» протеолиза ученые понимают степень гидролиза белка молока до свободных аминокислот, а под «шириной» - общие масштабы протеолитических процессов [3, 4]. Установлено, что эти процессы существенно влияют на органолептические показатели готовых сыров. В этой связи необходимо проводить качественную и количественную оценку активности протеолитической системы плесневых грибов, используемых в сыроделии. Ассортимент сыров с плесневой микрофлорой, развивающейся как на поверхности, так и внутри сырной головки, связан с действием многих факторов физической, химической, микробиологической и биохимической природы. Большое значение принадлежит виду используемого молока, его физико-химическому составу и свойствам, микробиологическому состоянию, режимам подготовки для переработки на сыр, составу, свойствам и активности используемой заквасочной микрофлоры, способам ее применения, технологическим параметрам получения сырной массы; режимам и продолжительностисозреваниясыров. Целью настоящей работы является изучение каталитической активности ферментных систем грибов Penicillium сaseicolum и оценка интенсивности протеолиза ферментных систем грибов Penicillium сaseicolum совместно с сычужным ферментом. Объекты и методология исследования Объектами исследований на разных этапах работы являлись: коровье молоко высшего и первого сорта по ГОСТ Р 52054, соответствующее требованиям «Технического регламента на молоко и молочную продукцию» № 88-ФЗ от 12.06.08; плесневые грибы рода P. сaseicolum, соответствующие ТУ 10-02-02-91 «Культуры плесеней для мягких сыров», разрешенные к применению в порядке, установленном законодательством Российской Федерации, обеспечивающие получение сыров, соответствующих классификационным характеристикам и требованиям документов в области стандартизации; молокосвертывающий ферментный препарат по ОСТ 10 288 «Препараты ферментные молокосвертывающие». При выполнении научно-исследовательской работы применяли стандартные, общепринятые, а также оригинальные методы исследования. Активную кислотность определяли потенциометрическим методом с помощью потенциометрического анализаторапоГОСТ 26781. Каталитическую активность протеолитической ферментной системы плесневых грибов оценивали по изменению массовой доли нингидринположительных веществ в реакционной смеси. Принцип метода заключается в наблюдении и последующем обсчете изменения содержания нингидринположительных продуктов в реакционной смеси и либо внеклеточного фермента исследуемого микроорганизма, накапливающийсявсреде [5, 6]. Активность протеолитического комплекса с помощью метода Бенке. Результаты и ихобсуждения Качество сыра зависит от направленности и интенсивности ферментативных реакций, в результате которых готовый продукт приобретает характерные органолептические показатели (вкус, аромат, запах). Важную роль при этом играют липолиз и протеолиз, протекающие под действием ферментов, присутствующих в молоке, закваске и плесневых грибах. В табл. 1 представлена каталитическая активность некоторых ферментных систем, локализованных в мицелии плесневых грибов P. сaseicolum. Таблица 1 Каталитическаяактивностьферментныхсистем плесневыхгрибов рода P. caseicolum Наименование фермента Значение активности, мкМ/мг белка ч Протеаза 1,20±0,07 Металлопротеаза 1,14±0,06 Карбоксипептидаза 1,17±0,07 Аминопептидаза 1,17±0,07 Липаза кислая 1,06±0,06 Липаза щелочная 1,43±0,08 Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что плесневые грибы рода P. caseicolum содержат высокоактивную протеолитическую и липолитическую ферментные системы. Наибольшей каталитической активностью обладает кислая протеаза, кислая карбоксипептидаза имеет такую же каталитическую активность, как и щелочная аминопептидаза. В технологии производства сыра с плесневыми грибами P. caseicolum для развития плесневых грибов, коагуляции молока и получения сырного зерна используется сычужный фермент. Сычужный фермент способствует протеканию неспецифичного протеолиза, что способствует образованию необходимой консистенции и вкуса готового сыра. Кроме этого, сычужный фермент путем гидролиза as1-и β-казеинов катализирует реакцию отщепления гликомакропептида от κ-казеина на участке Фал105 - Мет106 при сквашивании сырого молока при созревании сыра, подготавливает субстрат для действия протеолитических ферментов плесневых грибов P. caseicolum [6]. С целью более глубокого изучения протеолитических реакций, протекающих в процессе созревания сыров с плесневыми грибами P. сaseicolum, проводили исследования, направленные на определение качественного и количественного состава пептидного профиля сыра. Технологический процесс производства сыра с использованием плесневых грибов Penicillium caseicolum начинается с приемки основного и вспомогательного сырья с последующей оценкой его качества. После нормализации молоко пастеризуется при температуре (75±2) °C с выдержкой 20-25 с, охлаждается до температуры (32±2) °C, затем добавляется водный раствор хлористого кальция, бактериальная закваска, состоящая из молочнокислых стрептококков, и молокосвертывающий фермент. Время свертывания составляет 25-35 мин. При этом готовый сгусток должен при расколе иметь острые края, выделять прозрачную сыворотку и иметь нормальную консистенцию по плотности. Далее осуществляется обработка сгустка и сырного зерна. Полученная масса подвергается второму нагреванию при температуре (38±2) °C в течение (15±5) мин, формуется наливом и направляется на самопрессование в течение 5-10 мин. Затем сырная масса направляется на чеддеризацию, плавление раствором соли 8-12 % при температуре (72±2) °C с последующим обсушиванием сыра при температуре (10±2) °C, относительной влажности реакционной среды 80 % в течение 8-10 ч, после чего на сыр наносится раствор чистых культур плесени путем окунания головок сыра в раствор или путем равномерного разбрызгивания его на поверхность сыра. Результаты исследований пептидных профилей, полученных в присутствии плесневых грибов P. сaseicolum с применением и без применения сычужного фермента, приведены на рис. 1 и 2. Анализ результатов исследований, представ-продуктов распада белков - массовая доля олиголенный на рис. 1, свидетельствует о том, что фер-пептидов и полипептидов, а также свободных амиментная протеолитическая система плесневых гри-нокислот увеличивается. Также установлено, что бов обладает высокой каталитической активно-введение в образец исследования дополнительно стью. Так, например, через 12 ч протеолиза в при-сычужного фермента ускоряет протеолитические сутствии плесневых грибов рода P. сaseicolum мас-процессы. Согласно представленным пептидным совая доля белка в исследуемом образце снизилась профилям увеличивается скорость накопления орна 9-13 %, отмечается интенсивное накопление ганических азотистых соединений (табл. 2). Таблица 2 Активность протеолитическойферментной системы плесневых грибов рода P. сaseicolum Продолжительность гидролиза, ч Массовая доля общего азота, % молоко с плесневыми грибами молоко с плесневыми грибами и сычужным ферментом белки пептиды свободные аминокислоты белки пептиды свободные аминокислоты B C D E F G 4,00±0,05 0,47±0,028 0,01±0,001 0,005±0,001 0,45±0,027 0,02±0,001 0,01±0,001 8,00±0,05 0,45±0,027 0,02±0,001 0,01±0,001 0,44±0,026 0,03±0,002 0,01±0,001 12,00±0,05 0,43±0,023 0,03±0,002 0,02±0,001 0,42±0,025 0,04±0,001 0,02±0,001 Таким образом, в ходе исследований провели ным данным и позволяют обосновать оптимальные анализ активности протеолитической ферментной технологические параметры производства сыров, системы плесневых грибов рода P. сaseicolum . По-созревающих с использованием плесневых грибов лученные результаты не противоречат литератур-P. caseicolum.
1. Gradova, I.B. Laboratornyy praktikum po obschey mikrobiologii. - M.: DeLiprint, 2001. - 130 s.
2. Gusev, M.V. Mikrobiologiya. - M.: Akademiya, 2003. - 150 s.
3. Davidovich, E.A. Sravnitel'naya ocenka selektivnyh mikologicheskih agarovyh sred dlya vydeleniya i podscheta kserofil'nyh plesnevyh gribov i osmotolerantnyh drozhzhey, prisutstvuyuschih v belom sahare-peske / E.A. Davidovich // Pischevaya i pererabatyvayuschaya promyshlennost'. Referativnyy zhurnal. - 2005. - № 4. - S. 1304.
4. Dilanyan, Z.H. Vliyanie drozhzhey Torulopsis 304 na process sozrevaniya sovetskogo syra / Z.H.Dilanyan, G.G. Blok, A.S. Sagoyan // Sbornik dokladov mezhvuzovskoy konferencii po molochnomu delu. - Erevan, 1971. - S. 163-166.
5. Prosekov, A.Yu. Sovremennye aspekty proizvodstva produktov pitaniya: monografiya / A.Yu. Prosekov. - Kemerovo: KemTIPP, 2005. - 381 s.
6. Sadovaya, T.N. Biotehnologiya syrov s plesnevymi gribami Penicillium: monografiya. - Kemerovo: Kuzbassvuzizdat, 2011. - 212 s.
