Видное, г. Москва и Московская область, Россия
Кемерово, Кемеровская область, Россия
Москва, г. Москва и Московская область, Россия
Лактаза (β-галактозидаза) – фермент класса гидролаз, катализирующий расщепление лактозы в желу-дочно-кишечном тракте на галактозу и лактулозу. В нашей стране производство низколактозных молочных продуктов и лекарственных средств для восполнения дефицита лактозы отсутствует. Получение их является перспективным направлением. В связи с этим проведен анализ микроорганизмов-продуцентов фермента β-галактозидазы, сделан вывод по полученным результатам, которые будут использованы в дальнейших исследованиях.
Лактаза, препараты β-галактозидазы, биосинтез, дрожжи.
Введение
Препараты β-галактозидазы прежде всего находят широкое применение в молочной промышленности и в тех отраслях, где возможно использование отходов молокоперерабатывающей промышленности, содержащих дисахарид лактозу. Лактоза является очень ценным углеводом, но сахар этот плохорастворим, несладкий, не усваивается часто животными организмами, не сбраживается дрожжами. Если с помощью β-галактозидазы осуществить его расщепление до галактозы и глюкозы, то эта смесь уже имеет сладкий вкус, хорошо растворяется в воде, глюкоза усваивается как животными, так и микроорганизмами. Обработка молока и молочных изделий препаратами β-галактозидазы позволяет обеспечить часть населения, страдающего лактазной недостаточностью, молочными продуктами, почти не содержащими лактозу [2].
Обработка молока ферментом при концентрировании, особенно при его последующем хранении при низких температурах, позволяет повысить стабильность продукта при регенерации. Гидролиз около 20–30 % лактозы молока при приготовлении мороженого позволяет предотвратить явление его кристаллизации и уменьшить на 1–2 % добавку сахарозы. Использование β-галактозидазы при приготовлении кисломолочных продуктов способствует более быстрому развитию молочнокислых микроорганизмов, что позволяет ускорить технологические процессы [3].
|
5 |
Непереносимость молока встречается у 15–30 % населения России и обусловлена дефицитом в организме человека фермента лактазы, который вырабатывается в тонком кишечнике и катализирует расщепление лактозы (молочного сахара) на глюкозу и галактозу, которые затем легко всасываются в кровь.
Коррекция лактазной недостаточности может быть осуществлена двумя путями: использованием молочных продуктов с частично гидролизованной лактозой либо приемом лекарственных препаратов, содержащих фермент лактазу.
В нашей стране производство низколактозных молочных продуктов и лекарственных средств для восполнения дефицита лактозы отсутствует. Импортные препараты, закупаемые в ограниченном количестве, не удовлетворяют спрос в нужном объеме. В связи с этим создание конкурентоспособного отечественного универсального препарата β-галак-тозидазы, который может быть использован как для предварительного гидролиза лактозы в молочных продуктах, так и для приема внутрь, является весьма актуальным и практически важным [5].
Конкуренция в сфере производства и применения препаратов β-галактозидазы оправдывает все возрастающие усилия ученых и производственников, направленные на поиск новых штаммов-продуцентов, изучение закономерностей биосинтеза ферментов и свойств ферментных белков – основы создания рентабельных биотехнологий их производства и применения [4].
Лактазу получают из различных источников: животных, растений и микроорганизмов (бактерии, грибы, дрожжи). Однако бактериальные ферменты небезопасны для применения в пищевой промышленности. Ферменты из животных и растительных источников дороги и неактивны. Наиболее пригодны для практического применения грибные и дрожжевые β-галактозидазы.
Целью работы является анализ известных микроорганизмов-продуцентов фермента, выделение лучших для дальнейших исследований.
Объекты и методы исследований
Теоретические и экспериментальные исследо-вания проведены в соответствии с поставленными задачами в научно-образовательном центре Госу-дарственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский тех-нологический институт пищевой промышленности». Весь цикл исследований состоял из нескольких взаимосвязанных этапов.
На первом теоретическом этапе для форму-лировки цели и задач собственных исследований проводили анализ доступной отечественной и зарубежной научной информации по теме работы.
Второй этап посвящен изучению микро-организмов, обладающих наибольшей лактазной активностью. На этом этапе контролируемыми параметрами были изменение скорости роста биомассы в процессе культивирования, определение оптимальной температуры, продолжительность культивирования. Далее определяли основные пара-метры выросших микроорганизмов: содержание сухих веществ, прирост биомассы и β-галакто-зидазную активность.
Объектами исследований на разных этапах являлись:
– микроскопические грибы Penicillium canescens F178;
– бактерии Bacillus subtilis В2273, Bacillus coagulans В4521 и Streptococcus thermophillus B5329;
– дрожжи Kluyveromyces marxianus Y3240 и Kluyveromyces lactis Y3268.
Представленные микроорганизмы являются активными продуцентами фермента β-галактозидазы. Питательные среды для вышеперечисленных штаммов микроорганизмов представлены в табл. 1–5.
Таблица 1
Состав среды для Penicillium canescens
|
Ингредиенты |
Количество |
|
Неохмеленное сусло 3,5 Б |
|
|
Агар |
|
Таблица 2
Состав среды для Bacillus subtilis
|
Ингредиенты |
Количество |
|
Дистиллированная вода |
|
|
Пептон |
|
|
Агар |
|
|
NaCl |
|
Таблица 3
Состав среды для Bacillus coagulans
|
Ингредиенты |
Количество |
|
Дистиллированная вода |
|
|
Обезжиренный фарш |
|
|
Пептон |
|
|
Агар |
|
|
NaCl |
|
Таблица 4
Состав среды для Streptococcus thermophillus
|
Ингредиенты |
Количество |
|
Пептон |
|
|
Дрожжевой экстракт |
|
|
Мясной экстракт |
|
|
Na2HPO4 |
|
|
KH2PO4 |
|
|
MgSO4×7 H2O |
|
|
Лактоза |
|
|
Агар |
|
|
Дистиллированная вода |
|
Таблица 5
Состав среды для Kluyveromyces marxianus
и Kluyveromyces lactis
|
Ингредиенты |
Количество |
|
NaNO3 |
|
|
KH2PO4 |
|
|
MgSO4×7 H2O |
|
|
KCl |
|
|
FeSO4×7 H2O |
|
|
Глюкоза |
|
|
Агар |
|
|
Дистиллированная вода |
|
Определение активной кислотности (рН) осуществляют потенциометрическим методом, используя электронный рН-метр. Использование данного прибора позволяет измерять pH в более широком диапазоне и более точно (до 0,01 единицы pH), чем с помощью лакмусовой бумаги. Данные заносят в таблицу.
Титруемую кислотность определяют методом титрования культуральной жидкости
Метод определения содержания сухих веществ – рефрактометрический. Этот метод основан на зависимости показателя преломления света от состава системы.
Для определения скорости прироста микроорганизмов используется метод отделения мицелия от культуральной жидкости при помощи фильтрования. Разность между массой фильтра с сухим мицелием и массой пустого фильтра является массой сухого мицелия, образовавшегося за период культивирования микроорганизма в термостате. Значения прироста биомассы заносят в таблицу. Исходя из полученных данных вычисляют общую скорость роста микроорганизма, измеряемую в г/ч.
Определение β-галактозидазной активности проводили в отфильтрованной культуральной жидкости,
гомогенизированной и без разрушения клеточной стенки на фотоэлектроколориметре при длине волны 405 нм.
Разрушение клеточных стенок осуществляют на гомогенизаторе SCIENTZ-II D, воздействуя на клетки ультразвуком с частотой 22 кГц, при следующем режиме: озвучивание клеток производится 4 раза, общее время 30 с, в течение которого импульсы продолжительностью 2 с чередуются с 2 с перерыва. Целью гомогенизации является высвобождение внутриклеточного фермента во внешнюю среду.
Результаты и их обсуждение
Существенным фактором, оказывающим влияние на рост и метаболизм микроорганизмов, является температура культивирования. Для выбора оптимальной температуры следили за изменением скорости роста биомассы, значения которой представлены в табл. 6.
Таблица 6
Изменение биомассы
в процессе культивирования микроорганизмов
|
Температура, оС |
Количество микроорганизмов, тыс. КОЕ/г |
|||
|
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
|
|
Penicilliun canescens |
||||
|
28±2 |
24±2 |
70±2 |
120±3 |
180±5 |
|
32±2 |
8±1 |
20±2 |
34±2 |
44±3 |
|
Streptococcus thermophillus |
||||
|
37±2 |
18±2 |
35±2 |
100±3 |
107±3 |
|
42±2 |
40±2 |
83±3 |
120±4 |
132±4 |
|
Bacillus subtilis |
||||
|
37±2 |
400±12 |
сплошной рост |
||
|
42±2 |
сплошной рост |
|||
|
Bacillus coagulans |
||||
|
37±2 |
сплошной рост |
|||
|
42±2 |
сплошной рост |
|||
|
Kluyveromyces marxianus |
||||
|
28±2 |
10±1 |
18±2 |
27±2 |
40±2 |
|
32±2 |
6±1 |
11±1 |
15±2 |
36±2 |
|
Kluyveromyces lactis |
||||
|
28±2 |
43±3 |
50±3 |
93±4 |
120±4 |
|
32±2 |
18±2 |
25±2 |
72±3 |
112±4 |
В результате анализа данных, представленных в табл. 6, можно сделать вывод о том, что оптимальной температурой для роста микроорганизма Penicilliun canescens является 28 ºС, для Streptococcus thermophillus – 42 ºС, для Bacillus coagulans и Bacillus subtilis – 37 ºС, для Kluyveromyces marxianus и Kluyveromyces lactis – 28 ºС. Дальнейшее культивирование представленных штаммов в пробирках на скошенном агаре и в жидких питательных средах проводили при выбранных температурах. Продолжительность культивирования для каждого штамма будет составлять 1, 3, 5 и 7 суток.
После культивирования микроорганизмов на жидких питательных средах определяют основные контролируемые параметры. В табл. 7 представлено содержание сухих веществ в питательной среде до культивирования, а также в фильтрате для каждого исследуемого штамма.
Таблица 7
Массовая доля сухих веществ в фильтрате
|
Массовая доля сухих веществ, % |
|||||
|
До культивирования |
Темпера-тура, оС |
В процессе культивирования |
|||
|
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
||
|
Penicilliun canescens |
|||||
|
1,1±0,1 |
28±2 |
1,1±0,1 |
1,2±0,1 |
1,2±0,1 |
1,5±0,1 |
|
Streptococcus thermophillus |
|||||
|
1,7±0,1 |
42±2 |
1,8±0,1 |
2,1±0,1 |
2,2±0,1 |
3,1±0,1 |
|
Bacillus subtilis |
|||||
|
2,5±0,1 |
37±2 |
2,9±0,1 |
3,0±0,1 |
3,1±0,1 |
3,6±0,1 |
|
Bacillus coagulans |
|||||
|
2,5±0,1 |
37±2 |
2,5±0,1 |
3,1±0,1 |
3,6±0,1 |
4±0,1 |
|
Kluyveromyces marxianus |
|||||
|
3,1±0,1 |
28±2 |
3,0±0,1 |
3,1±0,1 |
3,1±0,1 |
3,2±0,1 |
|
Kluyveromyces lactis |
|||||
|
3,1±0,1 |
28±2 |
3,6±0,1 |
3,6±0,1 |
3,7±0,1 |
4±0,1 |
По данным табл. 7 видим, что массовая доля сухих веществ возрастает с увеличением продолжительности культивирования. Наибольшая массовая доля сухих веществ наблюдается у штамма Bacillus coagulans и составляет (1,5±0,1) %, наименьшая – у Kluyveromyces marxianus и составляет (0,2±0,1) %.
Определение прироста биомассы у изучаемых микроорганизмов представлено в табл. 8. Прирост биомассы – это количественное увеличение популяции клеток микроорганизма за определенный промежуток времени. Этот способ наиболее пригоден, в частности, для организмов, образующих мицелий, нити или скопления клеток.
Таблица 8
Прирост биомассы
|
Температура, оС |
Биомасса, г |
Общая скорость роста, г/ч |
|||
|
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
||
|
Penicilliun canescens |
|||||
|
28±2 |
0,06±0,01 |
0,06±0,01 |
0,07±0,01 |
0,08±0,01 |
0,0028±0,01 |
|
Streptococcus thermophillus |
|||||
|
42±2 |
0,04±0,01 |
0,05±0,01 |
0,06±0,01 |
0,06±0,01 |
0,0022±0,01 |
|
Bacillus subtilis |
|||||
|
37±2 |
0,08±0,01 |
0,11±0,01 |
0,18±0,02 |
0,22±0,01 |
0,0061±0,01 |
|
Bacillus coagulans |
|||||
|
37±2 |
0,08±0,01 |
0,11±0,01 |
0,14±0,01 |
0,30±0,01 |
0,0065±0,01 |
|
Kluyveromyces marxianus |
|||||
|
28±2 |
0,16±0,01 |
0,2±0,01 |
0,23±0,01 |
0,56±0,01 |
0,0119±0,01 |
|
Kluyveromyces lactis |
|||||
|
28±2 |
0,03±0,01 |
0,06±0,01 |
0,16±0,01 |
0,33±0,01 |
0,00605±0,01 |
Наибольшим приростом биомассы отличаются дрожжи вида Kluyveromyces marxianus, общая скорость роста составляет (0,0119±0,01) г/ч, тогда как наименьшая скорость роста (0,0022±0,01) г/ч наблюдается у бактерий вида Streptococcus thermophillus. Таким образом, можно сделать вывод, что дрожжи активнее усваивают питательные и энергетические источники среды.
Наличие определенного фермента в препарате может быть установлено по результатам той реакции, которую катализирует фермент, т.е. по количеству образовавшихся продуктов реакции или уменьшению исходного субстрата. Результаты измерения приведены в табл. 9 и 10.
Определение активности проводили в отфильтрованной культуральной жидкости, гомогенизированной и без разрушения клеточной стенки на фотоэлектроколориметре при длине волны 405 нм. По получившейся оптической плотности определили лактазную активность по калибровочному графику (рис. 1).
Пересчет лактазной активности из мкмоль/мл в ед/мг белка перевели по формуле
(1)
Рис. 1. Калибровочный график по о-нитрофенолу
где Д – оптическая плотность, измеренная на спектрофотометре при 405 нм; С – концентрация о-нитрофенола, определяемая по калибровочной кривой (см. рис. 1), мкмоль/мл; Vинк.ср. – объем инкубационной среды, мл; Vе – объем ферментного раствора, мл; t – время гидролиза, мин; m – содержание белка в 1 мл ферментного препарата, взятого для гидролиза, мг.
Таблица 9
Изменение β-галактозидазной активности в процессе культивирования микроорганизмов
без разрушения клеточной стенки
|
Температура, оС |
Лактазная активность, ед/мг белка |
Общая лактазная активность, ед/мг белка |
|||
|
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
||
|
Penicilliun canescens |
|||||
|
28±2 |
0,23±0,05 |
0,55±0,05 |
1,14±0,05 |
1,45±0,05 |
0,84±0,05 |
|
Streptococcus thermophillus |
|||||
|
42±2 |
0,15±0,05 |
0,25±0,05 |
0,40±0,05 |
0,55±0,05 |
0,34±0,05 |
|
Bacillus subtilis |
|||||
|
37±2 |
0,31±0,05 |
0,49±0,05 |
0,74±0,05 |
0,98±0,05 |
0,63±0,05 |
|
Bacillus coagulans |
|||||
|
37±2 |
0,62±0,05 |
0,68±0,05 |
1,35±0,05 |
2,68±0,05 |
1,33±0,05 |
|
Kluyveromyces marxianus |
|||||
|
28±2 |
2,95±0,05 |
3,03±0,05 |
3,38±0,05 |
4,06±0,05 |
3,36±0,05 |
|
Kluyveromyces lactis |
|||||
|
28±2 |
0,68±0,05 |
1,05±0,05 |
1,43±0,05 |
1,89±0,05 |
1,26±0,05 |
Таблица 10
Изменение β-галактозидазной активности в процессе культивирования микроорганизмов
с разрушением клеточной стенки
|
Температура, оС |
Лактазная активность, ед/мг белка |
Общая лактазная активность, ед/мг белка |
|||
|
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
||
|
Penicilliun canescens |
|||||
|
28±2 |
0,26±0,05 |
1,0±0,05 |
1,25±0,05 |
1,69±0,05 |
1,05±0,05 |
|
Streptococcus thermophillus |
|||||
|
42±2 |
0,19±0,05 |
0,33±0,05 |
0,49±0,05 |
0,77±0,05 |
0,45±0,05 |
|
Bacillus subtilis |
|||||
|
37±2 |
1,60±0,05 |
1,66±0,05 |
1,97±0,05 |
2,28±0,05 |
1,88±0,05 |
|
Bacillus coagulans |
|||||
|
37±2 |
0,86±0,05 |
2,18±0,05 |
4,31±0,05 |
5,14±0,05 |
3,12±0,05 |
|
Kluyveromyces marxianus |
|||||
|
28±2 |
3,38±0,05 |
4,25±0,05 |
4,65±0,05 |
5,48±0,05 |
4,44±0,05 |
|
Kluyveromyces lactis |
|||||
|
28±2 |
0,74±0,05 |
1,11±0,05 |
2,09±0,05 |
2,35±0,05 |
1,57±0,05 |
Анализируя данные табл. 9 и 10, делаем вывод, что наибольшей лактазной активностью обладает штамм Kluyveromyces marxianus (общая лактазная активность составляет (3,36±0,05) и (4,44±0,05) ед/мг белка у негомогенизированной и гомогенизированной культуральной жидкости соответственно). Также высокой активностью отличается штамм Bacillus coagulans (общая лактазная активность составляет (1,33±0,05) и (5,14±0,05) ед/мг белка у негомогенизированной и гомогенизированной культуральной жидкости соответственно).
Наименьшая β-галактозидазная активность отмечается у штамма Streptococcus thermophillus, которая составляет (0,34±0,05) и (0,45±0,05) ед/мг белка для культуральной жидкости без разрушения биомассы и разрушенной. Заметное увеличение β-галакто-зидазной активности в процессе культивирования наблюдается на 5–7 сутки.
|
|
Выводы
Были исследованы штаммы микроорганизмов, обладающие β-галактозидазной активностью, и выбран наиболее продуктивный штамм – дрожжи Kluyveromyces marxianus.
Изучены основные показатели полученного фермента лактазы: общая β-галактозидазная активность неочищенного фермента составила (3,36±0,05) и (4,44±0,05) ед/мг белка у негомогенизированной и гомогенизированной
1. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Агропромиздат, 1987. - 335 с.
2. Докучаева, Г.А. Рынок ферментов: в ожидании перемен [Электронный ресурс]. - URL: http://www.abercade.ru/research/analysis/1988.html
3. Общая технология микробиологических производств / М.С. Мосичев, А.А. Складнев, В.Б. Котов. - М.: Легкая и пи¬щевая пром-сть, 1982. - 264 с.
4. Особенности продукции внеклеточных β-галактозидаз мицелиальными грибами / Л.И. Сапунова, И.О. Тамкович, А.А. Костеневич [Электронный ресурс]. - URL: immunopathology.com
5. Сухих, О.А. Получение препарата грибной β-галактозидазы для коррекции лактазной недостаточности: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 2007. - 21 с.
